Farmacia

Il corso di Biologia Molecolare approfondisce aspetti relativi alla struttura, organizzazione, replicazione e riparazione del materiale genetico nonché al flusso dell’informazione genetica attraverso i processi di trascrizione e traduzione. Vengono illustrati i meccanismi alla base della maturazione del RNA, del controllo dell’espressione genica a diversi livelli (trascrizionale, post-trascrizionale, traduzionale e post-traduzionale) analizzando anche il ruolo di RNA non codificanti. Sono discusse alcune metodiche di base per l’analisi degli acidi nucleici e lo studio dell’espressione genica. Vengono infine affrontati alcuni aspetti applicativi di interesse farmacologico dell’RNA interference e dell’editing genomico. Segue programma dettagliato del corso. COMPOSIZIONE CHIMICA, STRUTTURA E PROPRIETÀ DEGLI ACIDI NUCLEICI. [4 ore] Basi azotate, nucleosidi e nucleotidi. DNA: forme B (Watson e Crick), A e Z. Strutture alternative (tripla elica, cruciformi, forcine). Proprietà del DNA: spettro di assorbimento, denaturazione e temperatura di fusione (Tm). RNA: ribonucleotidi modificati e differenze col DNA. Strutture secondarie e terziarie. RNA catalitici: ribozimi. Virus a RNA. Organizzazione ed impacchettamento del DNA. Topologia del DNA, supercoiling e topoisomerasi. Topoisomerasi come bersaglio farmacologico. Il cromosoma batterico. Cromatina e cromosomi eucariotici. Nucleosoma, istoni e codice istonico. Genoma mitocondriale. REPLICAZIONE E RIPARAZIONE DEL DNA. [6 ore] Caratteristiche generali (semiconservativa, bidirezionale, semidiscontinua) ed origini di replicazione. Replicazione del DNA nei procarioti: DNA polimerasi (fedeltà e processività) ed altri fattori coinvolti. Replicazione del DNA negli eucarioti. Telomeri e telomerasi. Replicazione del DNA e ciclo cellulare. Danni e meccanismi di riparazione del DNA. Danni spontanei (deaminazioni, perdite di basi), chimici (alchilazioni, ROS, intercalanti) e fisici (dimeri di timina e rotture a doppio filamento). Errori replicativi e mismatch repair (MMR). Meccanismi di riparazione diretta e per escissione (BER, NER). Riparazione delle rotture a doppio filamento (HR, NHEJ). Risposta cellulare ai danni al DNA. Duplicazione del DNA come target farmacologico. TRASCRIZIONE E REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE. [18 ore] Caratteristiche generali ed RNA polimerasi. Trascrizione nei procarioti: Inizio (promotori e fattori sigma) e terminazione trascrizionale (terminatori). L’operone lac: il repressore lac e l’attivatore CAP. L’operone trp: attenuazione. Trascrizione negli eucarioti: RNA polimerasi eucariotiche e loro promotori. RNA polimerasi II: struttura dei promotori, inizio trascrizionale e fattori di trascrizione. Allungamento e terminazione. Enhancers e silencers. Motivi di legame al DNA dei fattori trascrizionali: helix-turn-helix, zinc finger, leucine zipper, helix-loop-helix. Trasduzione dei segnali ed attivazione trascrizionale. Metilazione del DNA. Isole CpG. Modificazioni istoniche e rimodellamento della cromatina. Maturazione degli RNA. Cenni sul processamento di rRNA e tRNA in procarioti ed eucarioti. Processamento degli mRNA eucariotici: capping, poliadenilazione e splicing. Lo splicing alternativo. Il trans-splicing. Rilevanza dello splicing in patologie umane e come bersaglio terapeutico. Cenni sui meccanismi di editing dell’RNA (conversione di basi ed inserzione di nucleotidi). CODICE GENETICO, TRADUZIONE E REGOLAZIONE TRADUZIONALE. [6 ore] Decifrazione e caratteristiche del codice (degenerazione ed universalità). Teoria del vacillamento. Concetti di Open Reading Frame (ORF) e cornice di lettura. Mutazioni: mutazioni puntiformi, inserzioni/delezioni e loro conseguenze. TRADUZIONE. Ribosomi procariotici ed eucariotici. tRNA ed amminoacil-tRNA sintetasi. Inizio traduzionale in procarioti ed eucarioti. Allungamento e terminazione della traduzione. CONTROLLO TRADUZIONALE: meccanismi di controllo globale e trascritto-specifici (eIF2alfa, ferritina, uORFs e GCN4, poliadenilazione citoplasmatica). CONTROLLO POST-TRASCRIZIONALE ED RNA REGOLATORI. [8 ore] Degradazione e regolazione della stabilità degli RNA (AU-rich elements). RNA regolatori nei procarioti: riboswitch e sequenze CRISPR. RNA regolatori negli eucarioti. I microRNA: biogenesi, processamento e funzioni. siRNAs, RNA interference (RNAi). I long non coding RNA (lncRNAs). Gli RNA circolari (cRNAs). Applicazioni. Inibizione gene-specifica mediante tecnologia antisenso e interferenza a RNA. Genome editing: zinc finger e talen nucleasi, CRISPR-Cas9. TECNICHE. [6 ore] Cenni sulla tecnologia del DNA ricombinante (enzimi di restrizione, vettori di clonaggio, librerie genomiche e di cDNA, vettori di espressione e proteine ricombinanti). Metodologie per lo studio del DNA e dell’espressione genica: Southern e Northern blot, colony hybridization, microarrays. Metodiche di sequenziamento del DNA: metodo di Sanger e Next Generation Sequencing (NGS). Polymerase Chain Reaction (PCR) e Real Time PCR. DNA fingerprinting. Metodiche per lo studio delle interazioni tra DNA e proteine: Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), DNA footprinting, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP).

Per un adeguato e soddisfacente apprendimento, è indispensabile che all’inizio del corso lo studente possegga sufficienti conoscenze di Biologia e di Chimica generale come forniti dai corsi di Biologia Farmaceutica e di Chimica Generale ed Inorganica erogati nel primo anno del corso di laurea. È inoltre importante ed auspicabile che lo studente abbia acquisito elementi di base di Chimica Organica e Biochimica, con particolare riguardo alle principali proprietà strutturali e funzionali delle proteine.

Qualunque testo di Biologia Molecolare di livello universitario che copra il programma dell’insegnamento può ritenersi adeguato, e lo studente può decidere in base alle sue preferenze quel manuale che gli sembra più chiaro e rispondente alle proprie esigenze. Ciò premesso, sono indicati di seguito alcuni testi recenti dove possono essere reperiti gli argomenti trattati a lezione: 1. Amaldi A. et al. BIOLOGIA MOLECOLARE Terza Edizione Casa Editrice Ambrosiana 2018 2. Watson J.D. et al. BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE Ottava Edizione Zanichelli 2022 3. Eventuale materiale didattico aggiuntivo/integrativo messo a disposizione dal docente sulle piattaforme e-learning o Classroom.

La frequenza del corso è fortemente raccomandata ed offre allo studente un vantaggio in termini di comprensione della materia d’insegnamento nel suo complesso e del grado di approfondimento richiesto. Gli studenti impossibilitati a frequentare dispongono comunque del programma dettagliato, del materiale didattico ausiliario eventualmente messo a disposizione e dell’assistenza del docente.

La modalità di valutazione è orale e tipicamente consiste di 3-4 domande finalizzate a valutare la conoscenza acquisita dallo studente sui vari argomenti trattati durante il corso. Per superare l’esame di Biologia Molecolare lo studente deve dimostrare di avere acquisito una conoscenza di base sufficiente della struttura e funzione degli acidi nucleici, dei meccanismi che regolano l’espressione genica, incluso il ruolo di RNA non codificanti, e di aver compreso le implicazioni, rilevanza e possibili applicazioni di queste conoscenze in campo farmacologico. Per conseguire il massimo dei voti (30/30 e lode) lo studente deve dimostrare di aver acquisito eccellente padronanza dei vari argomenti trattati durante il corso e di essere in grado di raccordarli in modo logico e coerente.

L’insegnamento di Biologia Molecolare viene svolto mediante lezioni frontali. Gli argomenti trattati sono generalmente di facile reperibilità sui testi consigliati. Materiale didattico ausiliario viene eventualmente reso disponibile agli studenti su Classroom e/o sul sito e-learning. Il docente rimane disponibile per chiarimenti durante l’orario di ricevimento.